液相色谱仪操作技巧大揭秘：从流动相准备到数据处理全流程指南

  - 如果是用于简单的化合物纯度检测，如分析化学合成药物的纯度，一般的等度液相色谱仪就能满足规定的要求。但如果要进行复杂混合物（如中药提取物中的多种成分）的分离和鉴定，就需要配备梯度洗脱功能的液相色谱仪，它能够最终靠改变流动相的组成来优化分离效果。

  - 对于小分子化合物（如有机农药残留分析），常规的反相液相色谱柱和仪器就能处理。而对于生物大分子（如蛋白质、核酸），则需要特殊的色谱柱（如尺寸排阻色谱柱用于蛋白质分子量测定）和仪器，仪器的泵要可提供较低的流速和稳定的压力，以避免破坏大分子结构。同时，为防止生物大分子的吸附和变性，在大多数情况下要采用生物兼容的材料制造的流路系统。2. **分离性能要求**

  - **柱效和分离度**：- 高柱效是实现良好分离的关键。如果对分离度要求很高，如在药物杂质谱分析中，要选择能够支持高柱效色谱柱（如粒径较小的填料，3μm或更小）的液相色谱仪。这类仪器的泵系统要能提供精确的流速控制，因为流速的微小变化会影响柱效和分离度。一般流速精度要达到±0.075%或更高。

  - 根据样品的性质，选择具有合适选择性的色谱柱和与之匹配的仪器。例如，对于手性化合物的分离，需要配备手性色谱柱的液相色谱仪，并且仪器的检测系统要能够对分离后的手性对映体进行灵敏的检测。有些仪器还能够最终靠改变流动相添加剂（如环糊精等手性选择剂）来增强手性分离的选择性。3. **检测系统需求**

  - **检测器类型**：- 最常用的是紫外 - 可见（UV - Vis）检测器，适合检测具有紫外吸收的化合物。如果要检测没有紫外吸收的化合物，如糖类，在大多数情况下要配备示差折光（RI）检测器或蒸发光散射（ELS）检测器。对于痕量分析（如环境水样中的微量有机污染物），荧光检测器（FLD）或质谱（MS）检测器能提供更高的灵敏度。选择仪器时要考虑其能否方便地连接和使用所需的检测器。

  - 不同的检测器有不同的检验测试范围和灵敏度。例如，UV - Vis检测器的检验测试范围通常在190 - 700nm，它的灵敏度取决于化合物的摩尔吸光系数等因素。而FLD的灵敏度可以比UV - Vis检测器高几个数量级，适合检测低浓度的荧光化合物。在选择仪器时，要根据样品中目标化合物的浓度范围和检测限要求来挑选合适的检测系统。4. **自动化程度和通量需求**

  - **自动化程度**：- 对于高通量的实验室（如药物研发中的化合物筛选），需要高度自动化的液相色谱仪，包括自动进样器、自动柱切换系统等。自动进样器能轻松实现批量样品的自动进样，提高分析效率，并能设置进样体积、洗针程序等参数，减少交叉污染。

  - 如果需要快速分析大量样品，如在食品安全质量检测实验室，要选择能够支持快速分析的液相色谱仪。这可能涉及到仪器的泵速、柱温控制和检测速度等多个角度的优化。例如，采用超高效液相色谱（UPLC）技术的仪器可以在极短的时间内完成分析，但其对仪器的耐压能力和系统的死体积等有更高的要求。5. **预算和售后服务**

  - **价格范围**：- 液相色谱仪的价格差异很大。基础的单泵等度液相色谱仪价格可能在几万元，而带有高级功能（如二维色谱功能、高灵敏度质谱检测器）的仪器可能会达到几十万元甚至更高。在预算有限的情况下，要根据实际的需求权衡功能和价格。

  - 良好的售后服务至关重要。包括仪器的安装调试、培训、维修和耗材供应等方面。选择有良好口碑和完善售后网络的品牌，能够保证仪器在出现一些明显的异常问题时能够及时得到解决，减少停机时间。**二、液相色谱仪操作技巧**

  - 根据分析方法选择正真适合的流动相溶剂。例如，反相色谱中常用的流动相是甲醇 - 水或乙腈 - 水体系。在配制流动相时，要使用高纯度的溶剂，并且要准确控制溶剂的配比。对于梯度洗脱，要精确设置不一样时间点的溶剂组成变化。能够正常的使用高精度的天平（精度达到0.0001g）和量筒（精度达到0.1mL）来配制流动相。

  - 流动相中的气泡会导致泵压不稳、色谱峰变形等问题。能够使用多种脱气方法，如超声脱气（将配制好的流动相放在超声仪中超声15 - 30分钟）、氦气脱气（向流动相中通入氦气，氦气在溶剂中的溶解度低，可以带走溶解的空气）等。2. **色谱柱安装与维护**

  - **安装**：- 安装色谱柱时，要确保柱两端的连接紧密。对不锈钢柱，要使用合适的扳手拧紧螺母，但别过度用力以免损坏柱子。对于毛细管柱，要注意插入深度和密封方式。在连接色谱柱到仪器的流路时，要注意流动相的流向要与色谱柱上标注的方向一致，避免反向流动损坏柱子。 - 新柱安装后，需要用流动相平衡一段时间。平衡时间依据色谱柱的类型和尺寸而异，一般为30分钟到数小时不等。例如，对于一根长250mm、内径4.6mm的反相色谱柱，用甲醇 - 水（70:30）流动相平衡大约1 - 2小时。

  - 定期检查色谱柱的性能，如柱效、分离度和压力。通过进样标准样品来评估柱性能。假如发现柱压升高，可能是柱子堵塞，能够尝试用适当的溶剂（如对于反相柱可以用乙腈 - 水体系）在较低流速下反向冲洗柱子，但要注意不是所有柱子都允许反向冲洗。 - 色谱柱在不使用时，要用合适的溶剂（如对于反相柱可以用甲醇）保存，防止柱子干涸和固定相损坏。

  - **手动进样**：- 手动进样时，使用合适的进样器（如注射器）。进样体积要准确，对于定量分析尤其重要。在进样前，要将进样器用流动相或样品溶剂冲洗几次，以避免残留杂质的干扰。进样时，动作要快，避免样品在进样阀处扩散。

  - 正确设置自动进样器的参数，如进样体积、进样速度、洗针程序等。洗针程序能防止样品交叉污染。例如，在进样复杂的生物样品后，要用强溶剂（如乙腈）和弱溶剂（如纯水）依次冲洗进样针，以彻底清除残留样品。4. **泵的操作与维护**

  - **流速设置**：- 根据分析方法准确设置泵的流速。在使用的过程中，要注意仔细观察泵压的变化。如果泵压突然升高或降低，可能是流路堵塞或泄漏等问题。一般来说，对于常规的分析柱（如内径4.6mm），流速范围在0.5 - 2mL/min比较常见。

  - 定期检查泵的密封件，如柱塞杆密封。假如发现有泄漏现象，要按时换密封件。同时，要保持泵的清洁，避免灰尘和杂质进入泵体。能定期用适当的溶剂（如甲醇）清洗泵的内部流路。5. **检测系统操作与维护**

  - **紫外 - 可见（UV - Vis）检测器**：- 设置合适的检测波长。能够最终靠扫描样品的紫外 - 可见吸收光谱来确定最佳检测波长。在检验测试过程中，要注意检查基线的稳定性。如果基线漂移，可能是流动相中有杂质、检测器灯老化等原因。定期更换检测器灯（依据使用频率，一般1000 - 2000小时更换一次）能够保证检测的灵敏度和稳定性。

  - 对于示差折光检测器，要注意保持检测池的温度稳定，因为气温变化会影响折光指数，进而影响检测结果。蒸发光散射检测器要注意雾化气和加热温度的设置，这些参数会影响检测的灵敏度和信号的稳定性。6. **数据处理与分析**

  - **积分参数设置**：- 正确设置积分参数，如峰宽、斜率、最小峰面积等。对于重叠的色谱峰，能够最终靠调整积分参数来做到合理的分离和积分。例如，对于拖尾的色谱峰，可以适当增加峰宽参数来确保整个峰被正确积分。

  - **定量方法选择**：- 根据分析要求选择正真适合的定量方法，如外标法、内标法或归一化法。外标法适用于已知标准品的定量分析，需要准确配制标准溶液并绘制校准曲线。内标法能够大大减少进样体积和仪器波动等因素的影响，在复杂样品分析中很常用。归一化法大多数都用在样品中各成分相对含量的测定，要求所有成分都能被检测到。